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由于部分城鎮(zhèn)地區(qū)的污水收集管網(wǎng)不完善，導(dǎo)致污水處理廠進(jìn)水C/N較低，不能有效實(shí)現(xiàn)生物脫氮。因此，污水處理廠常采用外加碳源的方式來(lái)滿足微生物代謝需求，常用碳源包括甲醇、乙酸、乙醇和葡萄糖等，但均存在運(yùn)行成本高、資源浪費(fèi)等問(wèn)題。此外，有研究利用活性污泥發(fā)酵液、檸檬酸生產(chǎn)廢水的濃縮液、藍(lán)藻發(fā)酵液等高濃度有機(jī)廢水作為碳源，取得了一定的脫氮效果。Fu等認(rèn)為利用某些高濃度工業(yè)廢水作為碳源，具有資源利用率高、生物降解性好的優(yōu)勢(shì)。

高濃度白酒釀酒廢水的COD較高，富含小分子醇類、酸類和醛類等物質(zhì)，可生化性好，是一種優(yōu)質(zhì)的反硝化碳源。筆者采用高濃度白酒釀酒廢水作為液體碳源，構(gòu)建反硝化生物處理系統(tǒng)，并研究容積負(fù)荷、溶解氧和停曝比對(duì)脫氮效能的影響，進(jìn)一步通過(guò)三維熒光光譜、掃描電子顯微鏡和宏基因組分析系統(tǒng)的微生物作用機(jī)理，旨在為釀酒廢水的資源化利用和低C/N生活污水處理提供技術(shù)支撐，實(shí)現(xiàn)“以廢治廢”。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器（MBBR）接種污水處理廠濃縮池污泥，通過(guò)混合廢水（COD=350mg/L、NH4+-N=37.5mg/L、TN=40mg/L、TP=4mg/L）培養(yǎng)3d，待系統(tǒng)掛膜完成后開(kāi)始處理污水。進(jìn)水采用人工模擬低C/N生活污水（COD=65mg/L、NH4+-N=35mg/L、TN=35mg/L、TP=2mg/L），加入白酒釀酒廢水（COD=270000mg/L、NH4+-N=2500mg/L、TN=6500mg/L、TP=2400mg/L）作為碳源，并添加微生物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：CoCl2·6H2O=0.15mg/L、FeSO4·7H2O=0.3mg/L、Na2MoO4·2H2O=0.06mg/L、CuSO4·5H2O=0.06mg/L、MnCl2·4H2O=0.12mg/L、H3BO3=0.15mg/L、KI=0.15mg/L、ZnSO4·7H2O=0.12mg/L、Na2WO4·2H2O=0.06mg/L、NiCl2·6H2O=0.15mg/L。

第一階段，控制溶解氧濃度為5～6mg/L，反應(yīng)器內(nèi)溫度為（30±1）℃，采用間歇式運(yùn)行方式（23.5h反應(yīng)+0.5h換水），通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究容積負(fù)荷對(duì)系統(tǒng)脫氮效能的影響；第二階段，在最佳容積負(fù)荷條件下，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究溶解氧濃度對(duì)系統(tǒng)脫氮效能的影響；第三階段，在最佳容積負(fù)荷和最佳溶解氧濃度條件下，研究停曝比對(duì)系統(tǒng)脫氮效能的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定

NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測(cè)定，TN采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定，TP采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定，COD采用快速消解分光光度法測(cè)定，pH和DO采用HACH便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析儀測(cè)定。

1.2.2 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜采用熒光光譜儀測(cè)定，激發(fā)光源為150W氙燈，固定激發(fā)波長(zhǎng)狹縫為5nm，掃描速度為12000nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)λEx=250~800nm，發(fā)射波長(zhǎng)λEm=250~800nm，光電倍增管（PMT）電壓為700V，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)。

將所測(cè)得的光譜圖案按特定激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)劃分為7個(gè)區(qū)域，各區(qū)域位置及其所代表的熒光物質(zhì)如表1所示。

1.2.3 掃描電子顯微鏡分析

采集最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)器中的生物膜，參考李彥澄等的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)生物膜進(jìn)行離心、固定、清洗、脫水、置換、鍍金處理后，采用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 宏基因組分析

采集反應(yīng)器中的生物膜保存于無(wú)菌EP管，并立即置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍保存，然后在冷凍條件下送至上海某生物公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序，主要流程為：使用FastDNASpinKitForSoil試劑盒抽提樣品DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA完整性，采用基因組剪切儀對(duì)檢測(cè)合格后的DNA片段進(jìn)行剪切，打斷為約400bp的片段，構(gòu)建PE文庫(kù)后進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增和Illumina測(cè)序。最后利用宏基因組云平臺(tái)對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括物種種類、功能豐度和代謝通路分析等。

2、結(jié)果與討論

2.1 污染物去除效能

當(dāng)容積負(fù)荷分別為0.044、0.067、0.089和0.111kgCOD/（m3·d）時(shí)，對(duì)應(yīng)進(jìn)、出水污染物平均濃度及去除率如圖1（a）所示。在不同容積負(fù)荷條件下，NH4+-N去除率均高于90%；當(dāng)容積負(fù)荷為0.111kgCOD/（m3·d）時(shí)，TN和COD的去除率均最高，說(shuō)明該系統(tǒng)的最佳容積負(fù)荷為0.111kgCOD/（m3·d）。

在系統(tǒng)容積負(fù)荷為0.111kgCOD/（m3·d）的條件下，溶解氧分別控制為1~2、2~3、3~4、4~5mg/L，結(jié)果如圖1（b）所示。在不同溶解氧條件下，系統(tǒng)對(duì)COD和NH4+-N的去除率均高于90%，且不隨溶解氧濃度的變化而出現(xiàn)較大波動(dòng)，但TN去除率隨溶解氧濃度的增加而降低。當(dāng)溶解氧為1~2mg/L時(shí)，TN去除效果最好，說(shuō)明該系統(tǒng)的最佳溶解氧為1~2mg/L，在該條件下，系統(tǒng)同時(shí)具有較好的硝化與反硝化效能。

在容積負(fù)荷為0.111kgCOD/（m3·d）、溶解氧為1~2mg/L的條件下，采用間歇曝氣方式，控制停曝比分別為4∶1、3∶1、2∶1和1∶1，結(jié)果如圖1（c）所示。在不同停曝比條件下，系統(tǒng)對(duì)COD的去除率均為94%左右；NH4+-N去除率隨停曝比的減小呈升高趨勢(shì)，當(dāng)停曝比為1∶1時(shí)，NH4+-N去除率高達(dá)（90.9±2.7）%；但TN去除率隨停曝比的減小呈先升高后降低的趨勢(shì)，在停曝比為3∶1時(shí)，TN去除率最高，說(shuō)明系統(tǒng)的最佳停曝比為3∶1。

2.2 溶解性有機(jī)物分析

通過(guò)三維熒光光譜分析系統(tǒng)進(jìn)、出水溶解性有機(jī)物的變化，了解微生物對(duì)其利用情況。采集最佳控制條件下的系統(tǒng)進(jìn)、出水進(jìn)行三維熒光光譜分析，結(jié)果如圖2所示。進(jìn)水均在Ⅲ區(qū)檢測(cè)到熒光峰，且熒光強(qiáng)度最高，在Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ區(qū)也出現(xiàn)一定強(qiáng)度的熒光帶，說(shuō)明進(jìn)水主要為類溶解性微生物代謝產(chǎn)物，也有一定濃度的類色氨酸蛋白質(zhì)物質(zhì)、類富里酸物質(zhì)、類黑精物和類木質(zhì)纖維素物質(zhì)。出水熒光譜圖中Ⅲ區(qū)的熒光強(qiáng)度明顯減弱，熒光峰明顯降低甚至消失，說(shuō)明釀酒廢水中的類溶解性微生物代謝產(chǎn)物被系統(tǒng)中微生物較好地利用。此外，出水在Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ區(qū)檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度均有所降低，說(shuō)明出水中類色氨酸蛋白質(zhì)物質(zhì)、類富里酸物質(zhì)、類黑精物和類木質(zhì)纖維素物質(zhì)在一定程度上被系統(tǒng)中的微生物降解。

2.3 微生物形態(tài)分析

通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察最佳控制條件下反應(yīng)器中的生物膜形態(tài)，結(jié)果如圖3所示?？芍到y(tǒng)中的微生物主要呈球狀、桿狀、絲狀和螺旋狀，這與Fan等研究中觀察到的微生物形態(tài)類似。好氧生物膜的微生物通常呈絲狀、桿狀和球狀，這些細(xì)菌參與同步硝化反硝化過(guò)程。絲狀菌在生物膜骨架中能為微生物附著提供有利環(huán)境，聚集更多微生物；球狀菌為NO2--N的積累提供了可能；桿狀菌可作為NH4+-N氧化的交換通道。此外，硝化菌和反硝化菌多為桿狀菌，如硝化桿菌、芽孢桿菌等。因此，合理控制容積負(fù)荷和溶解氧濃度有利于系統(tǒng)中微生物發(fā)生同步硝化反硝化作用，這主要是因?yàn)檫m量的碳源能為微生物提供電子供體，而在適宜的溶解氧濃度下，生物膜外層好氧區(qū)的微生物能較好地實(shí)現(xiàn)硝化作用，內(nèi)層缺氧區(qū)則有利于微生物進(jìn)行反硝化。

2.4 宏基因組分析

選取接種污泥（S0）、最佳容積負(fù)荷（S1）、最佳溶解氧濃度（S2）和最佳停曝比（S3）階段的微生物樣本進(jìn)行宏基因組分析，各樣本序列的組裝拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2所示（序列數(shù)分別為743040、598680、563910、577205）。

由表2可知，在4組樣本中，S0的序列數(shù)和總序列長(zhǎng)度均高于S1~S3，說(shuō)明經(jīng)混合廢水培養(yǎng)后，系統(tǒng)的微生物物種數(shù)量減少。N50和N90分別為組裝序列的累加值第一次超過(guò)所有序列總長(zhǎng)度的50%和90%時(shí)所掃描到的序列長(zhǎng)度，在4組樣本中，S2的N50和N90最大。4組樣本的最短序列長(zhǎng)度均為300bp，而所含序列最長(zhǎng)的樣本為S1。

屬水平上的物種豐度對(duì)比見(jiàn)圖4（a）。S0的優(yōu)勢(shì)屬分別為unclassified_c__Actinobacteria（4.97%）、unclassified_p__Chloroflexi（4.81%）、unclassified_c__Anaerolineae（4.60%）、unclassified_p__Bacteroidetes（4.55%）、小念珠菌屬、硝化螺菌屬。S1的優(yōu)勢(shì)屬分別為微白霜菌屬、丙酸菌屬、unclassified_c__Deltaproteobacteria（4.12%）、中村氏菌屬、unclassified_p__Acidobacteria（2.66%）。S2的優(yōu)勢(shì)屬分別為Micropruina（14.46%）、Propionibacterium（9.82%）、unclassified_p__Chloroflexi（3.87%）、unclassified_c__Deltaproteobacteria（2.74%）、Nakamurella（2.74%）。S3的優(yōu)勢(shì)屬分別為Micropruina（26.22%）、Propionibacterium（13.83%）、Nakamurella（2.97%）、unclassified_p__Actinobacteria（2.89%）、unclassified_p__Chloroflexi（1.60%）。與接種污泥相比，系統(tǒng)中豐度變化較大的菌屬分別為Micropruina、Propionibacterium、Nakamurella，說(shuō)明經(jīng)混合廢水培養(yǎng)后優(yōu)勢(shì)屬發(fā)生變化。Nakamurella作為硝化菌屬，在生物脫氮中起著關(guān)鍵作用；Micropruina能促進(jìn)有機(jī)物的降解以及氮的去除；Propionibacterium作為去除有機(jī)物的功能菌屬，能以乳酸作為碳源，在微好氧條件下生長(zhǎng)，而高濃度白酒釀酒廢水中富含高濃度的有機(jī)酸類物質(zhì)。同時(shí)，Nakamurella和Micropruina能在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存大量的糖類聚合物，可以發(fā)酵白酒釀酒廢水中由谷物產(chǎn)生的大量氨基酸和糖類，這可能與有機(jī)物的去除有關(guān)。S1～S3中的unclassified_p_Chloroflexi較S0有所降低，這可能與TN、NH4+-N被去除有關(guān)。種水平上的物種豐度見(jiàn)圖4（b）。豐度變化較大的菌種為Micropruina_glycogenica、Propionibacterium_sp.、Actinobacteria_bacterium、Nakamurella_multipartita、Anaerolineae_bacterium。在最優(yōu)控制條件下，均出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)種Micropruina_glycogenica，這是因?yàn)樵摼隇榈湫偷木厶蔷?，可在缺氧條件下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在脫氮過(guò)程中起著重要作用。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Actinobacteria_bacterium和Anaerolineae_bacterium中存在與氮循環(huán)相關(guān)的功能基因，具有生物脫氮功能。Nakamurella_multipartita能在細(xì)胞中積累大量多糖，常存在于含糖廢水中，因此當(dāng)添加釀酒廢水后，S1~S3均出現(xiàn)了Nakamurella_multipartita。

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)微生物功能進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖5所示。4組微生物樣本的碳代謝過(guò)程均注釋到6種功能，其中代謝功能占主導(dǎo)地位，其次是人類疾病、環(huán)境信息處理、組織系統(tǒng)、細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理；氮代謝過(guò)程均注釋到4種功能，其中代謝功能占主導(dǎo)地位，其次是環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、組織系統(tǒng)。碳代謝和氮代謝過(guò)程中參與代謝功能的微生物豐度最大，且均呈現(xiàn)S0整體豐度最小、S3整體豐度最大的現(xiàn)象。

進(jìn)一步分析碳代謝和氮代謝的完整路徑，發(fā)現(xiàn)4組樣本中存在47條與碳代謝相關(guān)的完整路徑，包括碳水化合物代謝（21條）、能量代謝（24條）、甲烷代謝（2條）。在碳代謝過(guò)程中豐度較高的分別為：三羧酸（TCA）循環(huán)、Arnon-Buchanan循環(huán)、Embden-Meyerhof途徑、第二次碳氧化。4組微生物樣本中與氮代謝相關(guān)的完整路徑有6條，包括反硝化作用、異化硝酸鹽還原、完全硝化、硝酸鹽同化作用、固氮作用、硝化作用，其中反硝化作用占主導(dǎo)地位。

3、結(jié)論

采用高濃度白酒釀酒廢水作為反硝化液體碳源，當(dāng)容積負(fù)荷為0.111kgCOD/（m3·d）、溶解氧濃度為1~2mg/L、停曝比為3∶1時(shí)，系統(tǒng)的脫氮效率最高。通過(guò)三維熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)對(duì)類溶解性微生物代謝產(chǎn)物的去除效果較為明顯，對(duì)類色氨酸蛋白質(zhì)物質(zhì)、類富里酸物質(zhì)、類黑精物和類木質(zhì)纖維素物質(zhì)等有一定的降解。采用掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，微生物主要為球狀、桿狀、絲狀和螺旋狀。通過(guò)宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)屬為Micropruina、Propionibacterium、Nakamurella?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋結(jié)果顯示，代謝功能占主導(dǎo)地位，系統(tǒng)中與氮代謝相關(guān)的完整路徑有6條，其中以反硝化功能為主；與碳代謝相關(guān)的完整路徑有47條，其中以TCA循環(huán)為主。